Empreinte digitale de masse de peptide

Empreinte digitale de masse de peptide (PMF) est une technique analytique pour protéine identification qui a été développée par John Yates et collègues (3). En bref, la protéine inconnue d'intérêt est fendue dans peptides par protéase comme Trypsine. La collection de peptides résultant de ce fendage comportent une marque unique de la protéine inconnue. Les masses absolues (toujours des peptides d'inconnu) sont exactement mesurées avec a spectromètre de masse comme MALDI-TOF ou ESI-TOF. Ces masses sont alors dans le silico comparé au génome. Les programmes de logiciel traduisent le génome connu de l'organization en protéines et puis coupent théoriquement les protéines en peptides avec de la même protéase (par exemple trypsine). Les masses absolues des peptides de chaque protéine alors sont théoriquement calculées. Une comparaison est faite entre la liste de la masse de peptide de la protéine inconnue et la liste théorique de la masse de peptide de chaque protéine codée pour dans le génome. Les résultats sont statistiquement analysés et la meilleure allumette à la question soumise de peptide est obtenue. Le grand avantage est que seulement les masses des peptides doivent être connues (ainsi non de novo ordonnancement) ; un inconvénient est que l'ordre de protéine doit présenter dans la base de données d'intérêt. En plus la plupart des algorithmes de PMF supposent que les peptides viennent d'une protéine simple. La présence d'un mélange peut de manière significative compliquer l'analyse et potentiellement compromettre les résultats.

Table des matières

Préparation témoin

Des échantillons de protéine peuvent être dérivés de SDS-PAGE (1) et sont sujets alors à des quelques modifications chimiques. Des ponts en bisulfure en protéines sont réduits et les acides aminés de cystéine sont carboxymethylated avant le fendage protéolytique. L'échantillon de protéine est coupé en plusieurs fragments en utilisant les enzymes protéolytiques tels trypsine, chymotrypsine ou Protéase V8. Un échantillon typique :le rapport de protéase est 50:1. La protéolyse est typiquement effectuée durant la nuit et les peptides résultants sont extraits au moyen acétonitrile et essayé sous vide. Les peptides sont alors dissous dans un peu d'eau distillée et sont prêts pour l'analyse spectrométrique de masse.


Analyse spectrométrique de masse

La protéine digérée peut être analysée avec différents types de spectromètres de masse tels qu'esi-TOF ou MALDI-TOF. MALDI-TOF est souvent l'instrument préféré parce qu'il permet une sortie plus élevée d'échantillon et plusieurs protéines peuvent être analysées dans une expérience simple. Une petite fraction du peptide (habituellement 1 microlitre ou moins) est introduite à la pipette sur une cible de MALDI et un produit chimique appelés matrice est ajouté au mélange de peptide. Les molécules de matrice sont exigées pour la désorption des molécules de peptide. Matrix et les molécules de peptide Co-se cristallisent sur la cible de MALDI et sont prêts à être analysés. La cible est insérée dans la chambre de vide du spectromètre de masse et l'analyse des masses de peptide est lancée par un rayon laser pulsé qui transfère des montants élevés d'énergie dans les molécules de matrice. Le transfert d'énergie est suffisant pour favoriser la transition de l'à semi-conducteurs dans l'état de gaz de molécules et de peptides de matrice. Une fois que les peptides ont écrit la phase gaseuse ils deviennent accélérés dans le champ électrique du spectromètre de masse et volent vers un détecteur d'ion où leur arrivée est détectée comme signal électrique. La masse de peptide est proportionnelle au Période de vol (TOF) dans le tube de dérive et peut être calculé en conséquence.

Analyse informatique

Le résultat de l'analyse spectrometrical de masse est une liste de poids moléculaires qui s'appelle souvent la liste maximale. Les masses de peptide sont maintenant comparées aux bases de données énormes comme Swissprot, Genbank ce qui contiennent l'information d'ordre de protéine. Les programmes de logiciel (2) ont coupé toutes ces protéines en peptides avec de la même enzyme utilisée dans le fendage chimique (par exemple trypsine). La masse absolue de tous ces peptides alors est théoriquement calculée. Une comparaison est faite entre la liste maximale des masses mesurées de peptide et toutes les masses des peptides calculés. Les résultats sont statistiquement analysés et des allumettes possibles sont retournées dans une table de résultats.

Littérature

  • 1) Mohd Nazri Ismail. 2005. Enduire Le Centre De Commande. La Science Malaisie D'Université.
  • 2) Clauser K. R., Baker P. R. et Burlingame A. L., Rôle de la mesure de masse précise (+/- 10 pages par minute) dans des stratégies d'identification de protéine employant la MME. ou la MME.Recherche de MME. et de base de données. Chemie Analytique, Vol.. 71. 14. 2871- (1999)
  • 3) P.R. De Griffon, MacCoss MJ, JK Anglais, RA De Blevins, Aaronson JS, Yates JR 3ème. Base de données directe recherchant avec des éventails de MALDI-PSD les peptides. Commun Rapide Spectrom De masse. 1995;9(15):1546-51.
  • 4)Shevchenko A, Jensen DESSUS, Podtelejnikov Poids du commerce, Sagliocco F, Wilm M, Vorm O, Mortensen P, Shevchenko A, Boucherie H, Mann M. Enchaînement du génome et du proteome par spectrométrie de masse : identification à grande échelle des protéines de levure des gels bidimensionnels.Proc Acad National Sci Etats-Unis. DEC 1996 10;93(25):14440-5.

Liens externes


Protéines: clef méthodes de l'étude

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